本试剂盒是基于远红荧光探针7-AAD可以特异性染色细胞球或类器官中丧失细胞膜完整性的坏死细胞而开发的一种细胞活力检测试剂盒。本试剂盒可快速、便捷、特异地对3D培养的细胞球或类器官中坏死细胞的细胞核染色。仅需染色10分钟，就可在荧光显微镜下观察到非常明亮的坏死细胞细胞核远红荧光染色。本试剂盒可与By3D Annexin V-FITC/EGFP/PE、Calcein AM等联用而用于3D细胞凋亡与坏死或死活的检测。本试剂盒适用于荧光显微镜、荧光酶标仪及其它荧光检测系统。
本试剂盒适用范围广。本试剂盒可用于常规方法培养出的3D细胞球或类器官，包括超低吸附细胞培养板、Matrix-Gel基质胶或Matrigel包被的平板、琼脂糖包被的平板、细胞悬滴培养板等。
本试剂盒使用便捷，整个检测过程仅需约10～30分钟即可完成。3D细胞球经凋亡、坏死等诱导处理后，将本试剂盒中的By3D 7-AAD染色液(100×)用检测缓冲液按照比例配制成By3D 7-AAD细胞活力检测工作液，避光孵育10分钟，就可进行后续的荧光显微镜拍照等荧光检测和分析。
7-AAD，英文全称为7-aminoactinomycin D，中文名称叫做7-氨基放线菌素D，是一种能够嵌入核酸的荧光指示剂，形成的DNA复合物在546nm激发光下能够产生647nm的最大发射光，这一特性使其常用于多色荧光显微镜或流式细胞实验中。
7-AAD和碘化丙啶(PI)类似，是一种非细胞膜渗透性的荧光染料，不能穿过具有生物活性的细胞质膜，因此被用来区分正常细胞与坏死细胞，也可以被用于细胞固定或通透后的核酸染色。与碘化丙啶(PI)不同的是，被546nm的氩离子激光激发后，7-AAD的发射光谱较PI窄，且发射波长更长，对其它检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品，可与多种488激发光激发的荧光染料联合使用，如FITC (异硫氰酸荧光素)、PE (藻红蛋白)、APC (别藻蓝蛋白)、Calcein AM等，在光谱的600nm左右有较弱的荧光，可用一般的荧光显微镜检测红色荧光，而在远红光650nm左右有较强的荧光，可用流式细胞仪FL3通道或配备650nm长通滤光片的荧光显微镜检测远红荧光。
| 组分 | 100T | 500T |
| By3D 7-AAD染色液(100×) | 100μL | 500μL |
| 检测缓冲液 | 10mL | 50mL |
保存：-20℃，避光，有效期1年。
- 须配备可以检测650nm波长的荧光显微镜以检测7-AAD的远红荧光。
- 本制品反复冻融可能会降低染色效果，为保证最佳使用效果，请尽量避免反复冻融，第一次解冻后可以适当分装保存。
- 细胞球在外力的作用下容易变形或分散，PBS洗涤及换液等过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 不同种类的细胞球对凋亡或坏死诱导剂的耐受可能存在一定的差别，3D细胞球经凋亡或坏死诱导后，形态可能会发生一些变化，在染色前可以镜下观察细胞球的形态，可以酌情考虑是否选择形态比较完整的细胞球进行染色分析。
- 荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽量当天完成检测。
- 如果有微生物污染，可能会严重影响检测效果。
- 染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致坏死细胞数量增加。
本步骤以96孔板，每孔接种100μL细胞为例，如使用其它类型的多孔板，各试剂使用量请按照相应比例进行换算。
- 3D细胞的准备：
在96孔3D培养板中每孔接种100μL细胞，细胞的接种量根据具体的实验方案，例如培养天数、需要的3D细胞球状体的大小等确定，按照3D细胞培养方案培养细胞，并按照实验设计进行一定的处理。96孔3D培养板推荐使用3D细胞培养板包被液、3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板，或直接使用超低吸附96孔板、超低吸附黑色透明底96孔板等。- 为达到最佳的染色效果，具体的细胞球培养时间、药物等干预时间可以根据细胞种类、具体的实验需求等进行调整。例如，对于HCT-116细胞，通常接种培养48小时形成较为紧实的细胞球后进行干预和染色效果较好。
- 3D细胞7-AAD染色：
- By3D 7-AAD细胞活力检测工作液的用量：对于6、12、24、96孔板，每孔By3D 7-AAD细胞活力检测工作液的用量分别为0.5～1mL、200～500μL、100～200μL和50～100μL。
- By3D 7-AAD细胞活力检测工作液的配制：如下表所示，按照每孔需要100μL By3D 7-AAD细胞活力检测工作液的量，用检测缓冲液稀释配制适量的By3D 7-AAD细胞活力检测工作液。
样品数 10个样品 50个样品 100个样品 By3D 7-AAD染色液(100X) 10μL 50μL 100μL 检测缓冲液 0.99mL 4.95mL 9.9mL By3D 7-AAD细胞活力检测工作液 1mL 5mL 10mL - 配制好的By3D 7-AAD细胞活力检测工作液必须一次使用完毕，不能冻存。
- By3D 7-AAD染色液的最终浓度可以根据不同细胞系和实验体系通过预实验进行优化。By3D 7-AAD染色液的工作浓度通常为0.5～2×，推荐使用浓度为1×。
- 染色：小心吸除原有细胞培养液，沿着孔壁缓慢加入100μL By3D 7-AAD细胞活力检测工作液，在适宜于细胞培养的温度避光孵育10分钟。
- 为达到最佳的染色效果，具体染色时间可以根据细胞种类、培养天数、细胞球状大小等进行调整。
- 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。3D细胞球通常位于在培养板或培养皿等培养器皿的底部，培养板在对着光线时能看到孔内针尖大小的乳白色细胞球，吸除孔内液体时须尽量避开细胞球以免将细胞球吸走。可以根据孔内液体的体积将移液器调至合适的量程，例如需要吸除的液体体积为100μL，将200μL移液器的量程调整到50～70μL，避开细胞球从液体边缘缓慢、分次吸除。孔内加入液体时，沿着孔壁小心、缓慢加入，避免破坏或吹散3D细胞球。
- By3D 7-AAD细胞活力检测工作液的用量：对于6、12、24、96孔板，每孔By3D 7-AAD细胞活力检测工作液的用量分别为0.5～1mL、200～500μL、100～200μL和50～100μL。
- 荧光检测：
- 荧光显微镜检测：孵育结束后，小心去除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后在荧光显微镜下观察荧光染色效果。注意整个过程均需注意避光操作。
- 须配备650nm长通滤光片的荧光显微镜检测远红荧光。
- 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 荧光酶标仪检测：孵育结束后，小心吸除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后用荧光酶标仪检测(7-AAD为红色荧光，Ex/Em=546/647nm)。通过对比对照组荧光探针的RFU，可以计算出正常细胞与坏死细胞的相对比例关系。
- 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 荧光显微镜检测：孵育结束后，小心去除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后在荧光显微镜下观察荧光染色效果。注意整个过程均需注意避光操作。
本试剂盒内提供检测缓冲液，可以简单便捷地进行细胞坏死检测，同时又能维持正常细胞的状态。使用本制品联合Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒和3D细胞Hoechst 33342染色液检测细胞凋亡与坏死的效果参考图1。使用本制品联合3D细胞Calcein AM染色液和3D细胞Hoechst 33342染色液检测细胞活力与坏死的效果参考图2。
图1．本试剂盒联合Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒和3D细胞Hoechst 33342染色液对于3D培养的HCT-116细胞的染色效果图。5000个HCT-116细胞在使用3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板中培养48小时，100μM Camptothecin诱导细胞球凋亡、坏死过夜，然后吸除培养液后直接加入1×的By3D 7-AAD细胞活力检测工作液(和Annexin V-FITC染色液混合配制在一起)，染色15分钟。结果显示，By3D 7-AAD细胞活力检测试剂盒对于药物诱导坏死后的3D细胞染色效果清晰、明亮，Annexin V-FITC染色的凋亡细胞膜可见明显差别(B、G)，7-AAD染色的3D细胞球内部坏死更严重一些(H、J)，同时Control组无明显7-AAD荧光染色(C、E)，Hoechst 33342染色的细胞核总体基本一致(D、I)。实际检测效果会因细胞株、实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
图2．本试剂盒联合3D细胞Calcein AM染色液和3D细胞Hoechst 33342染色液对于3D培养的HCT-116细胞的染色效果图。5000个HCT-116细胞在使用3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板中培养48小时，100μM Camptothecin诱导细胞球凋亡、坏死过夜，然后吸除培养液后直接加入1×的By3D 7-AAD细胞活力检测工作液(可以和By3D Calcein AM染色液混合配制在一起)，染色10分钟。结果显示，By3D 7-AAD细胞活力检测试剂盒对于药物诱导坏死后的3D细胞染色效果清晰、明亮，Calcein AM染色的活细胞可见明显差别(B、G)，7-AAD染色的3D细胞球内部坏死更严重一些(H、J)，同时Control组无明显7-AAD荧光染色(C、E)，Hoechst 33342染色的细胞核总体基本一致(D、I)。实际检测效果会因细胞株、实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
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